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产品简介
T7 High Yield RNA Synthesis Kit for Co-transcription( low dsRNA)用于共转录加帽体系，试剂盒进行了共转录反应体系的优化，使用的T7 RNA聚合酶是对野生型T7 RNA聚合酶进行了改造优化，突变得到的可以大幅度降低dsRNA含量的T7 RNA 聚合酶，以含有T7 启动子序列的线型双链DNA为模板，NTPs以及帽子类似物为底物，对启动子下游的DNA序列进行转录，高效合成带有Cap1结构的单链RNA。转录时可在底物中加入修饰的核苷酸，制备生物素或染料标记的RNA。
本试剂盒可以合成长转录本以及短转录本，以1 μg的模板投入量可以产生100-200 μg的RNA。该试剂盒使用共转录加帽策略来产生 Cap1 RNA。此外，UTP 也被 N1-Me-Pseudo UTP 取代以降低免疫原性。转录合成的RNA可用于诸如RNA结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交、RNAi、显微注射及体外翻译等多方面的下游应用。
产品信息
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货号 |
10634ES10 / 10634ES50 / 10634ES60 / 10634ES70 |
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规格 |
10 T / 50 T / 100 T / 500 T |
组分信息
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组分编号 |
组分名称 |
10634ES10 |
10634ES50 |
10634ES60 |
10634ES70 |
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10634-A |
T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA) |
20 μL |
100 μL |
200 μL |
1 mL |
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10634-B |
10×Transcription Buffer |
20 μL |
100 μL |
200 μL |
1 mL |
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10634-C |
ATP（100mM） |
20 μL |
100 μL |
200 μL |
1 mL |
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10634-D |
CTP（100mM） |
20 μL |
100 μL |
200 μL |
1 mL |
|
10634-E |
GTP（100mM） |
20 μL |
100 μL |
200 μL |
1 mL |
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10634-F |
N1-Me-Pseudo UTP（100mM） |
20 μL |
100 μL |
200 μL |
1 mL |
|
10634-G |
Control DNA Template（500ng/μL） |
5 μL |
10 μL |
20 μL |
100 μL |
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10634-H |
DNase I (2 U/μL) |
10 μL |
50 μL |
100 μL |
500 μL |
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10634-I |
Cap1 Analog（100mM） |
20 μL |
100 μL |
200 μL |
1 mL |
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10634-J |
Lithium chloride solution |
300 μL |
1.5 mL |
3 mL |
15 mL |
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10634-K |
RNase-free ddH2O |
500 μL |
2.5 mL |
5 mL |
25 mL |
储存条件
-25~-15℃保存，有效期1年。
使用说明
使用说明正文
- DNA模板制备
带有双链T7启动子的线性化质粒或PCR扩增产物都可以作为体外转录模板，模板可以用TE缓冲液或RNase free H2O溶解。
T7启动子序列： TAATACGACTCACTATAA*GG （注：A*为RNA转录的第一个碱基）
1）质粒模板
将目的DNA插入含有T7启动子的质粒载体中，然后用限制酶进行处理，待完全线性化后进行纯化。
注：
- 环状质粒由于没有有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物，为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化。
- 质粒线性化所选限制酶需要在启动子区域右侧、插入DNA片段的下游，且在插入DNA片段中无识别位点。选择的限制酶要能形成5’突出或者平滑末端。
- 为了避免蛋白及盐离子等对体系的影响，质粒线性化后建议纯化后再作为模板进行体外转录。
图1：线性化质粒为模板体外转录过程
2）PCR产物模板
带T7启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。首先将T7启动子序列(TAATACGA CTCACTATAAGG)加在有义链的上游引物的5’端，然后在高保真酶的作用下扩增含T7启动子的DNA模板，随后进行转录。PCR产物可以不经纯化直接作为模板，但纯化后会得到更高的RNA产出。
注：
- PCR产物作为模板，必须电泳确认产物的特异性及浓度，建议20μL反应体系投入2-5μL PCR产物。
- 为了得到更多高品质的RNA，推荐PCR产物胶回收之后再作为模板进行体外转录。
- RNA体外转录
1）试剂解冻
将T7 RNA Polymerase Mix短暂离心，置于冰上。将除 T7 RNA Polymerase Mix外的其他所需组分解冻并振荡混匀，短暂离心收集于管底，10×Transcription Buffer置于室温，其他组分置于冰上，备用。
2）室温装配转录反应
表1 共转录RNA配制体系
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组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
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RNase free H2O |
Up to 20 |
- |
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10×Transcription Buffer |
2 |
1× |
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CTP / GTP/ ATP/ N1-Me-Pseudo UTP (100 mM each) |
2 each |
10 mM each |
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Cap1 Analog (100mM) |
2 |
10 mM |
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模板DNA |
1 μg |
- |
|
T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA) |
2 |
- |
注：
- 反应于室温配置。由于10×Transcription Buffer中含有亚精胺，低温下亚精胺浓度过高会引起DNA模板沉淀。
- 短转录本（<100nt），模板可使用2ug，转录时间增至4-8个小时。
- 长转录本（>1000nt），建议使用质粒线性化模板进行转录。
- 建议在PCR仪中进行反应，热盖打开，防止长时间导致反应液蒸发。
- 反应产物可能有白色沉淀。这是反应过程中游离的焦磷酸与反应液中的镁离子形成焦磷酸镁，不影响后续实验。如想去除，添加EDTA即可消失。添加EDTA如果影响后续实验，也可以离心回收上清。
- 使用试剂、容器等无RNase污染。
3）37℃孵育2-3个小时
将上述反应液混合均匀，短暂离心至管底，37℃孵育2-3个小时。若转录本长度小于100nt，增加反应时间至4-8个小时。
4）DNaseⅠ处理（可选）
反应完成后，每管加入1 μL DNaseⅠ，37℃孵育15min以去除模板DNA。
- 产物纯化
转录后的RNA可以使用氯化锂沉淀法，以去除蛋白、游离的核苷酸。纯化后的RNA经电泳检测后可进行下游实验或存储于-80℃。
采用氯化锂沉淀法，RNA长度要大于300nt，且浓度不能低于100ng/μL。
- 向20μL反应混合物中，加入30μL RNase free H2O和30μL氯化锂。
- 混合均匀后，置于-20℃至少30min，以最大转速，4℃离心15min，收集沉淀。
- 加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。
- 用20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。
- RNA定量
1）紫外吸收法
游离核苷酸会影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。然后通过测定产物的A260读数来确定RNA的产量。对于单链RNA，1 A260相当于40µg/mL，所以RNA的产量可以如下计算： A260 x 稀释倍数 x 40 = µg/mL RNA
2）染料法
用RiboGreen染料进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。
- RNA大小及质量检测
1）琼脂糖电泳法
为了确定RNA的大小，完整度以及质量，需要进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
2）Agilent Bioanalyzer检测法
可以用来评估RNA完整度及质量，它仅需要少量的RNA进行分析，高品质的RNA在电图上应呈现明显且锐利的峰。
注意事项
1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 反应体系中须严格注意不要混入RNase。
4. 实验器材（如：枪头、产品管等）注意严格使用 RNase Free用品。
Ver.CN20250122
