产品简介

 

本产品是大肠杆菌重组表达来源的噬菌体 T7 RNA 聚合酶，是对野生型T7进行了改造优化，突变得到的可以大幅度降低dsRNA含量的T7 RNA 聚合酶组成的混合物，以含有 T7 启动子序列的双链 DNA 为模板，以 NTPs 为底物，合成与启动子下游的反向单链 DNA 互补的RNA。双链线性平末端或 5’突出末端 DNA均可作为 T7 RNA 聚合酶的底物模板，因此线性质粒、PCR 产物均可用作体外合成 RNA 的模板。转录时可在底物中加入修饰的核苷酸，制备生物素或染料标记的RNA。

 

产品信息

 

货号	10632ES20 / 10632ES60 / 10632ES70 / 10632ES80
规格	20 μL / 100 μL / 200 μL / 1 mL

 

组分信息

 

组分名称	10632ES20	10632ES60	10632ES70	10632ES80
T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA)	20 μL	100 μL	200 μL	1 mL

 

储存条件

 

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用说明

 

1. DNA模板制备

带有双链T7启动子的线性化质粒或PCR扩增产物都可以作为体外转录模板，模板可以用TE缓冲液或RNase free H₂O溶解。

T7启动子序列： TAATACGACTCACTATA(G/A)*GG   （注：(G/A)*为RNA转录的第一个碱基）

 

图1：RNA体外转录过程

1）质粒模板

将目的DNA插入含有T7启动子的质粒载体中，然后用限制酶进行处理，待完全线性化后进行纯化。

注：

1. 环状质粒由于没有有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物，为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化。
2. 质粒线性化所选限制酶需要在启动子区域右侧、插入DNA片段的下游，且在插入DNA片段中无识别位点。选择的限制酶要能形成5’突出或者平滑末端。
3. 为了避免蛋白及盐离子等对体系的影响，质粒线性化后建议纯化后再作为模板进行体外转录。

图2：线性化质粒为模板体外转录过程

2）PCR产物模板

带T7启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。首先将T7启动子序列(TAATACGA CTCACTATA(G/A)GG)加在有义链的上游引物的5’端，然后在高保真酶的作用下扩增含T7启动子的DNA模板，随后进行转录。PCR产物可以不经纯化直接作为模板，但纯化后会得到更高的RNA产出。

注：

1. PCR产物作为模板，必须电泳确认产物的特异性及浓度，建议20μL反应体系投入2-5μL PCR产物。
2. 为了得到更多高品质的RNA，推荐PCR产物胶回收之后再作为模板进行体外转录。

2. RNA体外转录

1）试剂解冻

将T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA)短暂离心，置于冰上。将除 T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA)外的其他所需组分解冻并振荡混匀，短暂离心收集于管底，10×Transcription Buffer置于室温，其他组分置于冰上，备用。

注：本产品不包含10×Transcription Buffer（货号：10670）和核糖核苷酸（货号：10652-10655）。

2）室温装配转录反应

表1 非修饰RNA配制体系

组分	体积（μL）	终浓度
RNase free H2O	Up to 20	-
10×Transcription Buffer	2	1×
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each)	2 each	10 mM each
模板DNA	1 μg	-
T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA)	2	-

表2 修饰RNA配制体系

组分	体积（μL）	终浓度
RNase free H2O	Up to 20	-
10×Transcription Buffer	2	1×
修饰型CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each)	2 each	10 mM each
模板DNA	1 μg	-
T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA)	2	-

修饰型NTP如：pUTP，5-Me-CTP，N1-Me-pUTP，5-OMe-UTP等

表3 共转录RNA配制体系

组分	体积（μL）	终浓度
RNase free H2O	Up to 20	-
10×Transcription Buffer	2	1×
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each)	2 each	10 mM each
Cap1 Analog (100mM)	2	10 mM
模板DNA	1 μg	-
T7 RNA Polymerase Mix(low dsRNA)	2	-

注：

1. 反应于室温配置。由于10×Transcription Buffer中含有亚精胺，低温下亚精胺浓度过高会引起DNA模板沉淀。
2. 短转录本（<100nt），模板可使用2ug，转录时间增至4-8个小时。
3. 长转录本（>1000nt），建议使用质粒线性化模板进行转录。
4. 建议在PCR仪中进行反应，热盖打开，防止长时间导致反应液蒸发。
5. 反应产物可能有白色沉淀。这是反应过程中游离的焦磷酸与反应液中的镁离子形成焦磷酸镁，不影响后续实验。如想去除，添加EDTA即可消失。添加EDTA如果影响后续实验，也可以离心回收上清。
6. 使用试剂、容器等无RNase污染。

3）37℃孵育2-3个小时

将上述反应液混合均匀，短暂离心至管底，37℃孵育2-3个小时。若转录本长度小于100nt，增加反应时间至4-8个小时。

4）DNaseⅠ处理（可选）

反应完成后，每管加入1 μL DNaseⅠ（RNase free）（货号：10611），37℃孵育15min以去除模板DNA。

3. 产物纯化

转录后的RNA可以选用RNA Cleaner磁珠进行纯化（货号：12602），也可以采用酚/氯仿纯化法，氯化锂沉淀法或柱纯化等，以去除蛋白、游离的核苷酸。纯化后的RNA经电泳检测后可进行下游实验或存储于-80℃。

1）RNA Cleaner磁珠纯化法

提前将RNA clean beads从4 ℃取出，平衡至室温（约30 min），并用RNase free H₂O将转录产物稀释至50μL。

1. 颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取2×磁珠（100μL）加入RNA样品中（50μL），用移液器吹打6次充分混匀。室温孵育5 min，使RNA结合到磁珠上。
2. 将样品置于磁力架上5 min，待溶液澄清后，小心移除上清。
3. 保持样品置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 s，小心移除上清。重复此操作一次。（注：漂洗时使用的80%乙醇需要使用RNase free H₂O新鲜配制，以防止引入RNase酶导致RNA降解。）
4. 保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5 min。（注：磁珠开盖晾干时要避免过分干燥，如果磁珠出现龟裂，则提示磁珠过分干燥，此时RNA的洗脱效率会降低）。
5. 将样品从磁力架上取出，加入22μL RNase free H₂O，用移液器吹打6次以充分混匀，室温静置5 min。
6. 将样品置于磁力架5 min，待溶液澄清后，小心转移上清20μL至一个新的RNase free PCR管中。（注：建议转移上清时留2-3μL液体，以免吸到磁珠影响后续实验。得到的RNA极不稳定，建议尽快进入下一步。若要保存，请置于-80℃保存。）

2）酚/氯仿纯化法

1. 向20μL反应混合物中，加入115μL RNase free H₂O和15μL 3M乙酸钠（pH5.2），混合均匀。
2. 用等体积的酚/氯仿（1:1）抽提一次，再用等体积的氯仿抽提2次，收集上清，并转移至新的RNase free EP管中。
3. 加入2倍体积的无水乙醇沉淀RNA。混合均匀后置于-20℃至少30min，以最大转速，4℃离心15min，收集沉淀。
4. 加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。
5. 用20μL RNase free H₂O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。

3）氯化锂沉淀法

采用氯化锂沉淀法，RNA长度要大于300nt，且浓度不能低于100ng/μL。

1. 向20μL反应混合物中，加入30μL RNase free H2O和30μL7.5M氯化锂。
2. 混合均匀后，置于-20℃至少30min，以最大转速，4℃离心15min，收集沉淀。
3. 加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。
4. 用20μL RNase free H₂O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。

4）柱纯化法

纯化前加入80μL RNase free H₂O将产物稀释至100μL，再按柱纯化说明书进行纯化。

4. RNA定量

1）紫外吸收法

游离核苷酸会影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。然后通过测定产物的A260读数来确定RNA的产量。对于单链RNA，1 A260相当于40µg/mL，所以RNA的产量可以如下计算：  A260 x 稀释倍数 x 40 = µg/mL RNA

2）染料法

用RiboGreen染料进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。

5. RNA大小及质量检测

1）琼脂糖电泳法

为了确定RNA的大小，完整度以及质量，需要进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

2）Agilent Bioanalyzer检测法

可以用来评估RNA完整度及质量，它仅需要少量的RNA进行分析，高品质的RNA在电图上应呈现明显且锐利的峰。

 

注意事项

 

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 反应体系中须严格注意不要混入RNase。

4. 实验器材（如：枪头、产品管等）注意严格使用 RNase Free用品。

 

 

Ver.CN20250122