限制性内切酶酶切反应结束后凝胶电泳，条带和预期不符，可能原因有哪些？

1）限制性内切酶产生星活性：严格按照试剂盒说明书设置反应条件。若为星活性导致，优化方案：①缩短酶切时间；②扩大反应体系体积；③降低酶的添加量。 2）酶切不完全，部分底物的酶切位点未被切割：可适当增加酶用量或延长孵育时间。若改善效果不佳，排查 DNA 底物：底物是否携带酶切抑制剂，可纯化 DNA 后重试；确认 DNA 是否存在甲基化，甲基化修饰会不同程度抑制内切酶识别切割位点。 3）存在外源限制性内切酶污染：污染物可来自操作过程、不纯 DNA 底物、未洁净离心管等；需更换全新试剂与耗材，重新配置体系实验。