限制性内切酶酶切反应结束后，未观察到切割迹象，哪些因素会抑制酶切？

1）影响因素：酶切底物 DNA 需要纯净无污染物。苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂、高浓度盐离子均会抑制限制性内切酶活性；部分内切酶对 DNA 二级结构敏感，DNA 缺刻、超螺旋结构会影响酶切效率；很多限制性内切酶对 DNA 甲基化敏感，需确认底物甲基化不会阻碍酶切反应。 2）排查方法：无法定位酶切失败原因时，建议使用阳性对照 DNA（含多个酶切位点，如 λDNA）平行反应。 ①若对照 DNA 可切开，样品底物切不开：将对照 DNA 与待测 DNA 混合共孵育。混合后对照底物仍可被切开，说明体系无抑制物，问题来源于待测 DNA 的二级结构； ②若混合后对照底物同样切不开，说明体系含有抑制物。