第三代Strep-tag纯化，蛋白未结合填料，如何解决？

1. 优化样品缓冲液
建议将样品缓冲液条件调整至与结合缓冲液（Buffer W: 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）一致。另外，注意以下几点：
pH: 最佳结合通常发生在 pH 8.0，在 pH 7.0 以下结合会减弱。
EDTA: 标准浓度为 1 mM，用于螯合可能干扰或激活金属蛋白酶的二价金属离子。如果纯化的是需要二价阳离子维持稳定或功能的金属蛋白，则建议省略EDTA。
还原剂: 目标蛋白聚集导致标签暴露不充分，可加入还原剂（例如，1 mM DTT）。
生物素污染: 某些细胞培养基（尤其是哺乳动物/昆虫细胞）或裂解液中存在的游离生物素会竞争性结合。建议在加载样品之前向裂解液中加入亲和素（avidin）螯合游离生物素。透析、换液也是去除生物素的方法。
2. 优化样品与填料的结合
流速: 在上样过程中，遵守推荐流速（≤ 150 cm/h 线性流速，或5 min停留时间），以保证足够的停留时间，实现有效结合。对于亲和力较低的相互作用或低浓度目标蛋白，降低流速可能提高结合产率。
浓度: 在溶解度允许范围内，尽可能使用高浓度的样品上样，以利于结合动力学并减少上样时间/体积。
3. 解决与标签可及性或丢失相关的问题
确认标签存在（Western blot, 测序）。
提高可及性：改变标签位置（N- vs C-端），改变接头长度/组成。
用 HABA 检查柱活性。