薯蓣皂苷激活髓系 AMPK，重建 Lgr5+ 干细胞稳态促进溃疡性结肠炎黏膜修复

1. 动物模型与分组

小鼠品系：选用 C57BL/6 遗传背景的野生型（WT）小鼠与髓系特异性 Prkaa1 敲除（Prkaa1^fl/fl;Lyz2-Cre，AMPKα1 缺失）小鼠，SPF 级条件下常规饲养；动物实验经所在机构动物伦理委员会批准。两组在同一批次的同一造模条件下接受处理，以保证基因型差异之外的变量可控。

分组与干预：急性模型设对照组、DSS 模型组、薯蓣皂苷低/高剂量组（60、120 mg/kg）、阳性药柳氮磺吡啶组及工具药联合组；慢性模型在同一框架下增设抗 CSF1R 抗体清除组与同型对照抗体组。所有指标在统一时间窗内取材，使急性与慢性两个模型之间的读数具备可比性。

2. 结肠炎诱导

DSS 化学诱导法（急性结肠炎）：以葡聚糖硫酸钠盐（DSS，MW 36000~50000，翌圣生物，货号 60316ES80）饮水给药诱导急性结肠炎，造模期间每日记录体重、粪便性状与便血情况，综合计算疾病活动指数（DAI）；造模结束后取材，测量结肠长度并评估脾脏、胸腺指数。

AOM/DSS 慢性方案（炎症相关异型增生）：先以氧化偶氮甲烷（AOM）单次腹腔注射启动，再以多轮“DSS 饮水—正常饮水”循环推进，模拟 UC 长期反复炎症之后的癌前病变过程，用于评价薯蓣皂苷对慢性期干细胞异常扩增与异型增生的作用。

3. 药物与工具药干预

治疗组：造模同期给予薯蓣皂苷灌胃，另设柳氮磺吡啶阳性药组、二甲双胍（AMPK 激活阳性对照）组以及 Compound C（AMPK 抑制剂）联合给药组，用于判断指标变化方向是否与 AMPK 通路激活一致，以及抑制该通路后保护作用是否消失。

靶点依赖性验证：体外采用分子对接与表面等离子共振（SPR）检测薯蓣皂苷与重组 AMPKα1β2γ1 三聚体的结合；细胞水平用 shRNA 敲低 AMPKα1，动物水平用髓系特异性 Prkaa1 敲除小鼠，从药理学与遗传学两条路径交叉验证依赖性。

4. 巨噬细胞清除

急性模型用氯磷酸脂质体清除巨噬细胞，对照组给予空载脂质体；慢性模型改用抗 CSF1R 抗体清除，同型抗体作对照。两种工具的作用机制互不重叠，可在不同疾病阶段重复同一套减法逻辑，避免把某一清除方式本身的非特异效应当结论。

5. 检测指标

【注】造模及给药期间每日记录体重与 DAI；取材时测量结肠长度、脾脏与胸腺指数，并采集外周血做血常规。结肠组织用于 H&E 染色、Ki67 免疫组化与 LGR5、F4/80、CD86、CD206、Muc2、ChgA、Fabp1 免疫荧光；炎症因子用 qPCR 与 ELISA 检测；巨噬细胞极化用流式检测 CD80/CD86；蛋白质组用 TMT 定量；干细胞功能用小鼠结肠隐窝来源的类器官评价出芽与表面积。

1. 急慢性两个模型中疾病活动度都下降，Lgr5⁺ 干细胞池无论被清空还是异常扩增都有效　

急性期里各剂量组的体重下降与 DAI 评分都被压住（图 1B、C），外周血白细胞升高、贫血、脾脏肿大、胸腺萎缩与结肠缩短这一组系统性改变一并回退，结肠大体形态与长度接近对照（图 1D–F），结肠 IL-1β 与 TNF-α 明显下降，H&E 上炎性浸润与结构破坏减轻（图 1G–I）。慢性 AOM/DSS 模型里的疾病活动度、结肠长度与炎症指标同样改善（图 1L–R），结肠内的异型增生病变在用药后减轻（图 1S）。

干细胞这一侧才是这篇论文的关键读数。急性期 DSS 让 LGR5 阳性信号大幅减少，薯蓣皂苷与阳性药柳氮磺吡啶都把它恢复回来（图 1J）；慢性模型里出现的是反方向的异常，AOM/DSS 让 Lgr5⁺ 细胞向隐窝上部异常扩增，两种药物都抑制了这个异常扩增并恢复隐窝基底部的定位（图 1T）。两个模型合起来看，薯蓣皂苷对干细胞池的作用更像双向的稳态控制——把偏离对照的表型拉回原位，而不是单向促进增殖。

图1｜原文Fig. 1

2. 薯蓣皂苷不直接促进上皮增殖，屏障保护经由抑制 M1 极化间接实现

这里要解决的是一个归因问题：屏障改善到底来自药物对上皮细胞的直接作用，还是来自药物改变巨噬细胞之后的上皮效应。论文先做 Caco-2 单培养，再引入条件培养基体系（图 2B），把巨噬细胞分泌的因子单独转移到上皮细胞上。单培养条件下薯蓣皂苷没有促进 Caco-2 增殖（图 2A）；换成 M1 巨噬细胞的条件培养基后，Caco-2 的紧密连接蛋白 Occludin 与 ZO-1 明显下降，而用药组巨噬细胞的条件培养基把这个下降大部分抵消（图 2C、D）——作用点因此落在上皮的上游。

巨噬细胞这一侧的读出在两套细胞系里各自独立且方向一致。THP-1 来源的 M1 细胞中 CD86、HIF-1α 与糖酵解酶 HK2 都被压低，IL-6 转录在 1.25 与 2.5 μM 下降最明显（图 2E–J）；RAW264.7 中 2.5 μM 以下没有明显细胞毒性，CD80 的流式信号与 CD86、IL-6、IL-1β、TNF-α 一并下降（图 2K–T）。代谢与线粒体这一层同样对得上：HIF-1α 蛋白下降，细胞内 ROS 累积减少，JC-1 染色显示线粒体膜电位得到保留（图 2U–X）。M1 极化本身伴随线粒体功能受损与糖酵解上调，这几个指标同向变化，说明药物改的是极化状态的代谢基础，而不只是某一个标志物的表达量。

图2｜原文Fig. 2

3. 蛋白组把差异收窄到代谢，IL-1β 在类器官上呈现随浓度翻转的效应

表型层面的结果之后，需要一个可以往下做的分子线索。论文对 M0、M1 与用药后的 M1 巨噬细胞做了 TMT 定量蛋白组：M0 向 M1 极化带来 769 个上调、1146 个下调蛋白，而薯蓣皂苷处理后的差异蛋白数量收窄到 58 个上调、19 个下调（图 3A、B），说明药物大幅减小了极化引发的蛋白组扰动。GO 富集与 KOG 注释都指向细胞因子分泌、上皮细胞分化与能量代谢，其中氨基酸、能量与脂质代谢通路最集中（图 3C–E）；火山图与热图显示 Stat1、NOS2、CD86、IL-1β、IL-6、TNF-α 在模型组升高、用药后回落（图 3F–H），其中 IL-1β 的降幅在全部炎症介质里最大。

类器官的部分是全文最反直觉的一组数据。低浓度区间（9.26 至 83.33 pg/mL）里 Lgr5 与 Axin2 的转录随浓度升高，类器官的生长与出芽维持在对照以上；到 250 pg/mL 时类器官出现结构不规则、出芽紊乱，而干性基因反而异常升高；浓度继续升到 6750 至 60750 pg/mL，生长被抑制、干性基因下降（图 3I–L）。同一个细胞因子在不同浓度区间给出方向不同的结果，提示薯蓣皂苷降低 IL-1β 的价值在于把它压回支持有序增殖的低浓度区间，彻底清除未必是目标。

图3｜原文Fig. 3

4. 清除巨噬细胞后药效整体消失，巨噬细胞是不可缺少的环节

前面的数据只支持相关，不支持必需。论文在造模前两天开始用氯磷酸脂质体清除巨噬细胞，同时保留一组对照脂质体（图 4A）；清除效率先由 F4/80 免疫荧光确认，脂质体组的巨噬细胞信号基本消失（图 4J）。在这个背景下，薯蓣皂苷原本能改善的体重下降、结肠缩短、外周血异常与脾脏胸腺指数全部退回接近模型组的水平（图 4B–H），结肠炎的病理表现与黏膜结构也失去保护（图 4I）。

干细胞侧的结论更直接。薯蓣皂苷原本能提高 LGR5 与 Ki67 的表达（图 4I、J），并把 Lgr5、Ephb2、Lrig1、Ephb3、Axin2、Ascl2、Tert、Hopx、Bmi1 这一组隐窝基底柱状细胞与 +4 位储备干细胞的标志物转录拉回（图 4K）；清除巨噬细胞之后这些恢复全部消失。分化方向上，分泌系标志物 Muc2 与 ChgA 的信号在用药组回升，吸收系标志物 Fabp1 的异常增强则回落（图 4L）；清除巨噬细胞后，Muc2 与 ChgA 的回升不再出现，Fabp1 也停留在高位。

图4｜原文Fig. 4

5. AMPKα1 被锁定为直接靶点，药理抑制与基因敲低各自验证一遍

蛋白组把作用落在能量代谢上，AMPK 是这条通路里最上游的能量感受器，需要回答的是药物与它之间是直接结合还是隔了几层。论文用分子对接与 SPR 两条独立的结合实验，再用药理学抑制与基因敲低验证依赖性。对接预测薯蓣皂苷与 AMPKα1 的结合自由能为 -6.9 kcal/mol，并在 Lys14 形成稳定氢键（图 5A）；SPR 在重组 AMPKα1β2γ1 三聚体上测得解离常数 18 μM（图 5X）。在未极化的 RAW264.7 里薯蓣皂苷已经能提高 p-AMPK 水平（图 5B、C）；到 M1 状态下，p-AMPK 与 p-Raptor 同时升高，胞内 ADP/ATP 比值上升（图 5D–F）——Raptor Ser792 磷酸化正是 AMPK 抑制 mTORC1 的直接手段，而 ADP/ATP 的变化说明细胞的能量感受状态确实被改变了。

依赖性验证分两路。加入 AMPK 抑制剂 Compound C 之后，薯蓣皂苷对 p-AMPK 与 p-Raptor 的提升，以及对 COX-2、HIF-1α、iNOS、CXCL10、IL-1β、TNF-α 与糖酵解产物乳酸、NO 的压制都被削弱（图 5G–O）；用 shRNA 敲低 AMPKα1 得到同样结论，Raptor 磷酸化不再被诱导，CD86 与 iNOS 也压不下去（图 5P–W）。药理学抑制剂与基因敲低两种手段给出同向结论，降低了脱靶的可能，这是把 AMPKα1 称作直接靶点的主要依据。

图5｜原文Fig. 5

6. 体内抑制 AMPK 保护作用跟着消失，髓系特异性敲除使药效完全丢失

体外证据充分不等于体内成立。实验设计里加了一组二甲双胍作为 AMPK 激活的阳性对照（图 6A），用来判断指标变化的方向是否与已知的 AMPK 激活一致。薯蓣皂苷与二甲双胍对体重、结肠长度与血液学指标的保护程度接近（图 6B–D）；机制指标上，两者都提高了结肠 p-AMPK（图 6E、F），降低了 IL-1β 与 TNF-α 的转录（图 6G、H），并减少了脾脏 CD11b⁺F4/80⁺CD86⁺ 这一群 M1 巨噬细胞的绝对数量（图 6I）——按脾脏总细胞数换算，排除了脾脏肿大带来的分母效应。加上 Compound C 之后这些效应全部被抵消。

图6｜原文Fig. 6

上皮侧，薯蓣皂苷恢复了黏膜结构、Ki67 阳性细胞与分泌黏液的细胞（图 6K），并上调 LGR5、Occludin 与 Muc2 蛋白（图 6L–N）；这些保护在 AMPK 被抑制后同样消失。更关键的是细胞类型的锁定：在 Prkaa1 对照小鼠里，薯蓣皂苷 60 mg/kg 明显减轻体重下降与结肠缩短，把脾脏指数拉回（图 7A–E），并改善黏膜结构与 LGR5 表达（图 7F、G）；同一剂量用到髓系特异性缺失的 Prkaa1 敲除小鼠身上，上述保护全部不再出现。免疫荧光上，F4/80 与 AMPKα1 的共定位、CD86 与 CD206 的改变在缺失小鼠里同样消失（图 7H）。同一剂量、同一模型，唯一差异是髓系细胞里缺了 AMPKα1，药效就没了——这是全篇最强的因果证据。

图7｜原文Fig. 7

7. 慢性异型增生模型改用抗 CSF1R 抗体清除，结论与急性模型一致

急性模型用氯磷酸脂质体得到的结论，是否只是那一种清除方式本身的副作用？慢性 AOM/DSS 模型改用抗 CSF1R 抗体清除巨噬细胞，这是作用机制完全不同的另一种工具（图 8A）。清除后结肠 F4/80 信号大幅减少，验证有效（图 8J）；薯蓣皂苷在同型对照抗体组里改善了体重、DAI、血液学与脾脏胸腺指标（图 8B–F），降低了结肠 IL-1β 与 TNF-α（图 8G、H），并减轻了炎症浸润与异型增生病变（图 8I）；换成抗 CSF1R 组之后这些保护基本消失。

干细胞这一侧的结果与急性模型互为印证。同型对照背景下薯蓣皂苷恢复了 Lgr5⁺ 细胞的数量与隐窝基底定位（图 8J），并把 Lgr5、Ascl2、Axin2、Lrig1 的转录拉回（图 8K）；清除巨噬细胞后，Lgr5⁺ 干细胞池在用药组反而出现异常扩增，与用药本身的方向相反——说明这条调控必须经过巨噬细胞。两个模型分别用了两种清除工具，同一结论在两种工具、两个疾病阶段下都能复现，把某一种清除方式本身的非特异效应排除掉了。

图8｜原文Fig. 8

这套设计的说服力来自两点。其一，急性与慢性模型的干细胞表型方向相反，任何单向促增殖的解释都会自相矛盾，两个模型必须用同一个双向调控的机制才能同时解释，说服力比只做急性模型更强。其二，清除工具与遗传学手段互补——Compound C（dorsomorphin）的选择性在文献里一直有争议，它同时抑制 BMP 受体等其他激酶，只靠它下结论是这个领域常见的薄弱环节；这篇工作把药理学抑制、shRNA 敲低与髓系条件敲除三条独立证据放在一起，等于用遗传学补上了药理工具的信度缺口。

作者在讨论里自己列了三条局限：体外巨噬细胞实验基本采用同时给药的方式，无法区分薯蓣皂苷主要是阻止炎症发生还是逆转已有炎症，需要预处理与后处理两套方案以及时间序列监测才能回答；剂量依据来自既往药效与毒理研究，而薯蓣皂苷口服生物利用度偏低，本文没有测血浆与结肠组织的药物暴露量，无法建立暴露与效应的关系；肠道炎症微环境里巨噬细胞只是免疫网络的一个组成部分，其他免疫细胞群的贡献有待进一步拆分。

还有两处证据可以更硬。一是 SPR 用的是昆虫细胞表达的重组三聚体，与细胞内带翻译后修饰、又与膜和细胞骨架有相互作用的复合物并不是同一种状态；按 18 μM 的解离常数推算，2.5 μM 下的占据率并不高，药理效应却已接近饱和，更像是变构激活这类不依赖高占据率的机制在起作用。在细胞里补一组浓度梯度的热位移实验，把 Kd 与 p-AMPK 的浓度效应曲线画在一起，可以把“直接靶点”从重组蛋白推进到细胞层面。二是类器官实验用的是重组 IL-1β，而机制叙事说的是巨噬细胞来源的 IL-1β，中间缺一步——拿用药后巨噬细胞的条件培养基直接刺激类器官，再配 IL-1 受体拮抗剂或中和抗体做反向验证，两条线才能在同一体系里接上。

在相关研究中，可选用翌圣生物DextranSulfateSodiumSalt(DSS)结肠炎建模用葡聚糖硫酸钠盐MW:36000~50000（60316ES）进行小鼠结肠炎造模：