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ortho-iodoHoechst 33258属于能够穿过细胞膜并与活细胞或固定细胞的细胞核结合以进行标记的Hoechst系列染料，其通过特异性结合富含A/T区域的DNA双链小沟来结合核酸，该结合过程可使荧光信号显著增强，且染料的荧光强度会随着溶液pH值的升高而增加。
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