磁珠法去内毒素质粒大提实测

质粒大提的难点集中在三处：一是体量，200 mL 菌液的裂解物体积大，柱膜容易过载，离心步骤既费机时又费人力；二是内毒素，革兰氏阴性菌裂解后释放的脂多糖（LPS）会随质粒共纯化，转染时进入细胞即可引起毒性反应，常规细胞转染一般要求内毒素 ≤1 EU/μg；三是通量与重复性，手工柱提高度依赖手法，批间差异难控制。磁珠法配合特异的内毒素去除液，正好把这三件事一起解决：碱裂解后用内毒素去除液两步温控清除 LPS，再由磁珠在孔板中完成“吸附—洗涤—洗脱”，全程无酚氯仿、无大体积有机抽提，且可直接适配 24/96 通道核酸提取仪。

表1　常见去内毒素质粒制备方案对比

▸ 仪器设备：台式离心机、磁力架、金属浴、小型离心机、涡旋振荡仪、96 通道（或 24 通道）自动化核酸提取仪。

▸ 耗材：15 mL 24 深孔板 6 块、24 深孔磁棒套、无水乙醇、含对应抗生素的 LB 培养基。

▸ 核心试剂：MolPure® Magnetic Endo-free Plasmid med Kit 磁珠法去内毒素质粒中量提取试剂盒（18543ES）。

▸ 试剂预处理①：首次使用前，将 RNase A（18543-A）全部加入到 Buffer P1（18543-C）瓶中，充分混匀后使用，做好标记，2–8 ℃ 保存。

▸ 试剂预处理②：提前打开水浴锅，温度调至 42 ℃，备用于内毒素去除步骤的温浴。

▸ 试剂预处理③：按瓶身标示，18543ES48 中的 Wash Buffer B（18543-I）每瓶需加入 72 mL 无水乙醇。

① 从新鲜培养的平板中挑取一个单克隆菌落，接种到含对应抗生素的 LB 培养基中，37 ℃ 剧烈振荡培养 12–16 h。

② 取 100–200 mL 过夜培养的菌液至合适离心管中，4000 rpm 离心 15 min，吸弃上清液，倒扣离心管在吸水纸上吸干残液，收集菌体沉淀。本次实测每个样本投入 200 mL 菌液。

③ 按 10 倍用量加入 4–5 mL Buffer P1，枪头吹打后高速涡旋，充分重悬菌体沉淀。

④ 按 10 倍用量加入 4–5 mL Buffer P2，立即温和地上下翻转 10–20 次以充分裂解菌体，室温放置 3–4 min（不超过 5 min）。

⑤ 按 10 倍用量加入 4–5 mL Buffer P3，立即温和地上下翻转 10–20 次充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000 rpm 室温离心 10 min。

⑥ 转移上清至新离心管中，加入 1/10 体积的内毒素去除液（如 10 mL 上清加入 1 mL 内毒素去除液），颠倒混匀后置于 4 ℃ 冰箱冷藏 10 min，取出后 42 ℃ 温浴 10 min。

⑦ 12,000 rpm 离心 5 min，取上清至新离心管中，即得到样本处理液。

按照下表向 24孔深孔板中加入相应试剂，正确安装 24 深孔板并放置磁棒套：

表2　24 孔深孔板加样表

在 24 通道自动化核酸提取仪上运行如下 8 步提取程序（以 AP-24N 程序为例，全程无需人工暂停）：

表3　24 通道自动化核酸提取仪提取程序（AP-24N）

注：混合模式 M2 为混合 10 s、混合速度 200,000；M3 为混合 10 s、混合速度 300,000；“－”表示常温操作。仪器程序总时长约 30 min，其中第 7 步在 65 ℃ 下完成洗脱。

程序结束后，将洗脱得到的核酸溶液（板位 6）转移至新的离心管中，溶液可置于 −20 ℃ 短期保存、−80 ℃ 长期保存，并取样用 NanoDrop 测定浓度与 A260/A280、A260/A230。

4 个质粒样本（1E、R2、3L、R4）各以 200 mL 菌液投料、按 10 倍试剂用量放大提取，每个样本平行测定 2 次，结果如下：

表4　200 mL 菌液质粒大提实测数据（NanoDrop）

①  4 个 200 mL 样本的实测浓度介于 3003.16–5261.64 ng/μL，总体均值 3901.1 ng/μL；按 1 mL 洗脱体积折算，单管总产量约 3.0–5.3 mg。

② A260/A280 全线达标，蛋白残留极低。 8 次测定的 A260/A280 全部落在 1.99–2.04，均值 2.02，紧贴 1.8–2.0 的优质区间上沿，说明 Buffer P1/P2/P3 碱裂解与后续洗涤对蛋白、基因组 DNA 等杂质的去除十分彻底。

③ A260/A230 全线 ＞2.0，盐离子与有机杂质残留低。 8 次测定的 A260/A230 介于 2.41–2.49、均值 2.45，显著高于 2.0 的理想线。230 nm 处的吸收主要来自胍盐、乙醇等有机与无机杂质，这一结果说明内毒素去除液处理后的两步温控与 Wash Buffer A/B 的两次洗涤组合，清洗得非常干净。

④ 结论。 MolPure® Magnetic Endo-free Plasmid med Kit（18543ES）按 10 倍用量放大后，在 200 mL 菌液大提场景下表现稳定：毫克级产出、A260/A280 与 A260/A230 双优，且中提流程天然衔接自动化核酸提取仪，上机程序约 30 min 即可完成一批。

▸ 菌体要“新鲜”：37 ℃ 剧烈振荡培养 12–16 h 即可收菌；过度培养会导致宿主菌衰老裂解，释放基因组 DNA 与内毒素，反而拉低质量。

▸ 裂解要“温和”:加入 Buffer P2/P3 后上下翻转混匀、切勿剧烈涡旋，室温放置不超过 5 min，避免基因组 DNA 剪切断裂混入上清。

▸ 温控要“到位”：内毒素去除液处理必须完成 4 ℃ 冷藏 10 min + 42 ℃ 温浴 10 min 两步，温度与时间不足会直接影响内毒素清除效率。

▸ 乙醇要“加够”：Wash Buffer B 使用前按瓶标加入无水乙醇（18543ES48 每瓶 72 mL）并做好标记，漏加乙醇是洗不干净的头号原因。

▸ 磁珠要“混匀”：磁珠悬浮液使用前充分重悬，取液时剪去枪头尖缓慢吸取，避免挂壁与洒出导致孔间差。

▸ 洗脱要“趁热”：提取程序第 7 步在 65 ℃ 下洗脱 6 min，可有效提高质粒回收率；洗脱液转移后避免反复冻融。

表6　磁珠法质粒提取及配套产品（点击货号查看产品详情）