YSFluor® 568 NHS（琥珀酰亚胺酯）（44005ES）

YSFluor^Ⓡ568 NHS（琥珀酰亚胺酯）是一种荧光标记染料，常应用于标记蛋白质、抗体、多肽和核酸分子等。

以标记IgG抗体为例

1. 实验准备

IgG、DMSO（60313ES）、NaHCO₃（730324ES）_、葡聚糖凝胶G-25脱盐柱（20591ES）、PBS（41403ES）、NaN₃、BSA（36106ES）

注：用于标记的IgG中不得含有可与染料发生反应的胺类物质，如氨基酸、Tris、BSA、明胶等。若IgG中含有上述成分，建议预先使用pH约7.4的PBS缓冲液进行透析处理。叠氮类化合物通常不影响标记反应。

2. 实验步骤与方法

1）待标记抗体处理

使用0.1 M NaHCO₃溶液（pH≈8.3）稀释待标记抗体至终浓度为2.5 mg/mL。若抗体已溶解于磷酸盐缓冲液（如不含胺类化合物的PBS）中，可直接向抗体溶液中加入约10%体积的1 M NaHCO₃储备液，使NaHCO₃终浓度达到0.1 M。

注：a. 当蛋白浓度为2.5 mg/mL时，标记效率约为35%。蛋白浓度低于2.5 mg/mL时仍可进行标记，但标记效率可能降低；当蛋白浓度高于5 mg/mL时，标记效率可能有所提高。

b. 由于缓冲体系、蛋白纯度及实际反应操作存在差异，实际标记效率可能有所差异。

c. 若蛋白浓度过低，可采用超滤等方法进行浓缩。

2）制备染料储存液

将1 μmol本产品恢复至室温后，加入0.1 mLDMSO，充分涡旋混匀至完全溶解，配制成终浓度为10 mM的染料储备液。

若用于微量蛋白标记，可根据实际标记体系将染料储备液进一步稀释至适宜浓度。

注：a. 染料储备液建议于-25~-15℃避光保存。采用无水DMSO配制，适宜条件下可保存至少1个月。

b. 本产品也可使用去离子水（60168ES）配制。由于本产品在水溶液中会发生缓慢水解，因此采用水配制的染料溶液建议现配现用。

3）标记反应

a. 将蛋白溶液通过轻柔搅拌或涡旋方式充分混匀，随后逐滴加入15～25 μL的10 mM染料储备液，使染料与蛋白的摩尔比控制在9:1～15:1。本产品标记IgG抗体时推荐的DOL（平均每个蛋白分子结合的染料分子数）范围为5~6。

b. 室温下搅拌反应1 h。进行微量标记时，也可置于摇床（80471ES）上振荡孵育1 h。

注：标记反应进行期间，可同步按照步骤4）a预先平衡葡聚糖凝胶G-25脱盐柱。

4）标记蛋白的分离纯化

a. 使用PBS缓冲液（pH约7.4）平衡葡聚糖凝胶G-25脱盐柱。

b. 将步骤3）b所得标记反应液加入平衡后的脱盐柱，以PBS缓冲液进行洗脱。最先洗脱出的着色组分通常为染料-蛋白偶联物。

注：a 对于小规模标记反应，为减少产物在纯化过程中的过度稀释，可采用适宜的超滤装置去除游离染料。

b. 标记反应结束后，如不能立即进行分离纯化，可加入50 μL 1 M赖氨酸溶液（60716ES）终止反应。多数情况下无需进行此步骤，因为反应结束时剩余未反应染料通常已发生充分水解。

3. DOL的测定

1）抗体蛋白浓度的测定

C（mg/mL）= {[A₂₈₀−(A_max×C_f)] / 1.4}×稀释因子

式中：C为标记抗体的蛋白浓度（mg/mL）；稀释因子为样品进行光度测定时的稀释倍数；A₂₈₀和A_max为样品在280 nm处的吸光度以及在吸收波长处的吸光度；C_f是校正因子，本产品为校正因子0.46。

注：经脱盐柱洗脱后获得的标记蛋白溶液浓度可能较高，不宜直接用于吸光度测定。建议将样品稀释至约0.1 mg/mL后进行检测。可根据初始抗体用量（例如5 mg）及洗脱液总体积预估所需稀释倍数（即稀释因子）。

2）DOL的计算

DOL = (A_max×Mwt×稀释因子)/(ε×C)

式中：A_max、稀释因子及C同上述；Mwt为IgG的分子量150000；ε为染料的摩尔消光系数，本产品摩尔消光系数为88000；本产品标记IgG抗体的推荐DOL范围为5-6。

注：实际DOL可因蛋白性质及反应条件不同而存在一定波动，在适宜范围内通常不会明显影响后续实验应用。

-25~-15℃避光保存，有效期2年。