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产品名称: Hieff™ qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus)
  • 产品货号:11203ES03
  • 产品规格:1 ml (40rxn(25μl/rxn))
  • 产品价格:
  • 类别:荧光定量PCR(qPCR)
   
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    产品信息
    产品名称
    产品编号
    规格
    储存
    价格(元)
    HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus)
    11203ES03
    1ml
    -20避光
    198.00
    HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus)
    11203ES08
    5×1ml
    -20避光
    498.00
    产品描述
    HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(High Rox Plus)是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液Mix中含有热启动HieffTM DNA PolymeraseSYBR® Green IdNTPs、Mg2+及High Rox。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR,大大简化操作过程,降低污染几率
    本品采用的DNA聚合酶配体可以随温度变化实时调节DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子,使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。
    适用机型
    Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT FAST, StepOneTM, StepOne PlusTM.
    运输与保存方式
    冰袋运输。-20避光储存,有效期18个月
    本品避免反复冻融产品中含有荧光染料SYBR® Green I,保存或配制反应体系时需避免强光照射。
    注意事项
    1. 解冻后Master Mix可能出现絮状物质,4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清,不影响试剂性能。
    2. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒(货号:11123),以有效去除RNA样品中残留的基因组。
    3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
    反应体系(推荐冰上配制)
    组分
    体积(μl
    体积(μl)
    终浓度
    HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus)
    25
    10
    Forward Primer (10μM)
    1
    0.4
    0.2μM
    Reverse Primer (10μM)
    1
    0.4
    0.2μM
    模板DNA
    X
    X
    -
    无菌超纯水
    to 50
    to 20
    -
    使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。
    a) 引物浓度:通常引物终浓度为0.2μM,也可以根据情况在0.1-1.0μM之间进行调整。
    b) 模板浓度:如模板类型为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10
    c) 模板稀释cDNA原液建议5-10倍稀释,最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。
    d) 反应体系推荐使用20μl50μl,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
    e) 体系配制请于超净工作台内配制,使用无核酸酶残留的枪头、反应管推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染


    扩增程序(两步法)                               扩增程序(三步法)

    循环步骤
    温度
    时间
    循环数
     
    循环步骤
    温度
    时间
    循环数
    预变性
    95
    5min
    1
     
    预变性
    95
    5min
    1
    变性
    95
    10sec
    40
     
    变性
    95
    10sec
    40
    退火/延伸
    60
    30sec
     
    退火
    55-60
    20sec
    熔解曲线阶段
    仪器默认设置
    1
     
    延伸
    72
    20sec
     
     
     
     
    熔解曲线阶段
    仪器默认设置
    1

    【注】高特异性可选择两步法高效率扩增可选择三步法
    a) 预变性时间:根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2min。
    b) 退火温度和时间:请根据引物和目的基因的长度进行调整。
    c) 荧光信号采集(:请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置,几种常见仪器的时间设定如下:
    30sec以上:Applied Biosystems: StepOneTM, StepOne PlusTM, 7500 FastRoche Applied Science: LightCycler® 480Bio-Rad: CFX96TM
    31sec以上:Applied Biosystems: 7300
    34sec以上:Applied Biosystems: 7500
    d) 解曲线通常情况下可以使用仪器默认程序。
    结果分析
    定量实验至少需要三个生物学重复反应结束后需要确认扩增曲线及解曲线。
    1) 扩增曲线标准扩增曲线为S型。
    Ct值落在20-30之间时,定量分析最准确
    Ct值小于10需要将稀释模板后,重新进行验;
    Ct值介于30-35之间时,需要提高模板浓度,或者增大反应体系的体积,以提高扩增效率,保证结果分析的准确性;
    Ct值大于35时,检测结果无法定量分析基因的表达量,但可用于定性分析。
    2) 熔解曲线
    熔解曲线单峰,表明反应特异性好可以进行定量结果分析;若解曲线出现双峰或者多峰,则不能进行定量分析。
    熔解曲线出现双峰,需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
    如果是引物二聚体,建议降低引物浓度,或者重新设计扩增效率高的引物。
    如果是非特异性扩增,请提高退火温度,或者重新设计更高特异性的引物。
    引物设计指南
    1. 推荐引物长度25bp左右。扩增产物长度150bp为佳,可以在100bp-300bp内选择。
    2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2引物Tm值60-65为佳。
    3. 引物碱基分布要均匀,避免出现连续的4个相同碱基,GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C
    4. 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列
    5. 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补
    6. 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测,只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析