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产品名称: Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix
  • 产品货号:12302ES05
  • 产品规格:500 T
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  • 类别:Modules
   
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    价格(元)

    Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix

    12302ES05

    500 T

    -20℃

    1526.00

     产品描述

    本产品是用于lllumina®平台高通量测序文库浓度绝对定量的专用试剂盒,提供定量所需的DNA标准品、qPCR Master Mix、定量扩增引物和参比染料ROX。其中,DNA标准品包含经梯度稀释的六份450 bp的双链DNA片段溶液,浓度为20 pM-0.0002 pM;扩增引物对根据NGS文库接头序列P5P7设计,可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子;qPCR Master Mix是基于抗体法热启动的染料法qPCR预混液,可在不同长度、不同GCAT含量样本中高效、特异扩增,实现精确定量。

    本试剂盒已经过严格的质量和功能检测,试剂盒所有组分均达到DNA污染控制的严格质控要求,应用于NGS文库定量精确灵敏,且批间稳定,结果重现性优异。

    产品组分

     

    组分名称

    规格

    12302ES05

    12307ES09

    Hieff NGSTM SYBR qPCR Master Mix (2×)

    5×1 mL

    --

    qPCR Primer Mix

    600 μL

    --

    Rox (25 μM)

    200 μL

    --

    Rox (250 μM)

    200 μL

    --

    DNA Standards 1-6

    6×96 μL

    --

    注意:

    1. 根据仪器类型选择合适的参比染料ROX

    类别

    机型

    不添加ROX

    Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™; Cepheid SmartCycler®; Eppendorf Mastercycler®ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene®Q, Rotor-Gene®3000, Rotor-Gene®6000; Roche Applied Science LightCyclerTM480; Thermo Scientific PikoReal Cycler.

    添加Rox (250 μM)

    Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne™, StepOnePlus™.

    添加Rox (25 μM)

    Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, ViiA™7; Stratagene MX4000™, MX3005P™, MX3000P™

    2. qPCR Primer Mix 中包含一对引物,序列如下,可预先通过引物序列确认文库是否可以被该引物对扩增。

    Primer 15-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3

    Primer 25-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3

    运输与保存方法

    冰袋运输。所有组分应-20℃保存,qPCR Master MixROX避光保存,效期6个月;如短期内反复使用,qPCR Master Mix可解冻后于4℃避光暂存,效期3个月。

    注意事项

    一、关于操作

    1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    2. 请于使用前确保产品冻融和彻底混匀,短暂离心收集至管底后置于冰上备用。

    3. 为保证产品品质,避免反复冻融超过30次!

    4. 为避免样品交叉和气溶胶污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

    5. 试剂吸取时应保证枪头适当深入液体,排出时应确认枪头无残留。

    二、关于文库稀释

    文库需稀释至标准曲线有效Ct范围内进行定量,稀释比例可参照过往经验或使用其他测定方式测定的浓度作为参考(如NanoDrop™Qubit®Bioanalyzer)。使用本试剂盒可定量的文库浓度范围参见下表。

    由于DNA在非缓冲环境中易降解,因此应使用缓冲稀释液(10 mM Tris-HClpH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20)稀释文库,切勿使用水作为稀释液。测定时,文库应现测定现稀释,置于冰上待测,切勿使用以往配制的储存的稀释后文库。

    1  DNA Standard浓度

    DNA Standard

    摩尔浓度

    质量浓度

    拷贝数浓度

    Std 1

    20 pM

    5.5 pg/μL

    12×106 copies/μL

    Std 2

    2 pM

    0.55 pg/μL

    12×10copies/μL

    Std 3

    0.2 pM

    0.055 pg/μL

    12×10copies/μL

    Std 4

    0.02 pM

    0.0055 pg/μL

    12×10copies/μL

    Std 5

    0.002 pM

    0.00055 pg/μL

    12×10copies/μL

    Std 6

    0.0002 pM

    0.000055 pg/μL

    12×10copies/μL

    三、污染与阴性对照(Contamination and No-template Controls

    1. 进行qPCR实验时,应保证良好的实验操作规范,以防对工作区域、试剂、耗材、仪器、DNA标准品等造成污染。推荐将反应体系配制区和模板制备区进行物理隔离,并定时使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂对各实验区域进行擦拭清理。

    2. 反应体系配制过程中DNA Standards的加入应按照从低浓度至高浓度(DNA Standard 61)的顺序进行,每次移液都应更换新的枪头,以避免气溶胶污染。

    3. 每次实验都应平行进行NTC阴性对照反应,配合融解曲线进行扩增特异性和体系污染程度分析。因扩增引物序列为Illumina®平台固定序列而非qPCR专用引物序列,且扩增循环数较多,NTC阴性对照反应出现引物二聚体扩增进而产生Ct属正常情况。正常情况下Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3

    扩增曲线基线设置

    DNA Standard 1的摩尔浓度远远高于常规qPCR模板,其Ct往往非常小。而大部分qPCR仪器都默认将3-15循环设置为基线(Baseline),有时会将DNA Standard 1Ct值误认为是测定时的噪声背景,继而影响标准曲线制作。手动设置基线(Baseline)为1-3循环可以有效避免这种情况发生。

    五、文库长度矫正

    为避免片段长度对文库绝对定量的影响,需要在定量结果计算时,对文库长度进行矫正。根据文库荧光染料SYBR® Green I结合DNA后产生的荧光强度与DNA分子量成正比的原则,根据以下公式进行文库浓度长度矫正。

    矫正后的稀释文库浓度(pM= [450 bp /文库平均长度(bp] × 稀释文库的浓度(pM

    六、融解曲线分析

    融解曲线在配合NTC阴性对照进行污染程度分析以及确认标准曲线最大有效Ct时至关重要,推荐每次实验都进行融解曲线采集步骤。本产品,DNA Standards产生的熔解曲线呈现特征单峰。

    使用方法

    一、解冻试剂

    Hieff NGSTM qPCR MixPrimer MixDNA Standards 1-6,文库稀释液(10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20),ROX Dye(如需要)从冰箱中拿出,冰浴解冻。各试剂解冻后,涡旋混匀,短暂离心后置于冰上备用。

    二、稀释文库

    使用文库稀释液10 mM Tris-HClpH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20对待测文库进行适当稀释。推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库,可额外设置32倍稀释梯度,如按1:1000稀释文库,可额外设置1:20001:40001:8000稀释比例,以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。

    三、反应体系配制

    于反应管中配制如下体系,上下颠倒或涡旋振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    2  qPCR反应体系

    名称

    体积

    Hieff NGSTM SYBR qPCR Master Mix

    10 μL

    qPCR Primer Mix

    1 μL

    Diluted DNA Library/DNA Standard 1-6/ddH2O*

    2 μL

    ddH2O

    7 μL

    Total

    20 μL

    注:1)每个反应至少设置3个平行;2)推荐进行20 μL反应体系,如需进行10 μL反应,则将体系各组分等比减少;3*在阴性对照反应管中加入ddH2O;在样品反应管中加入稀释后的文库;在标准曲线反应管中加入DNA Standards4)根据机型添加合适ROX,推荐加入量0.5 μL

    四、qPCR运行程序

    将反应管置于qPCR仪中,按下述条件设置qPCR反应程序,并运行(熔解曲线可根据仪器默认即可)。

    3  qPCR程序

    步骤

    温度

    时间

    循环数

    预变性

    95℃

    5 min

    1 cycle

    循环反应

    95℃

    10 sec

    40 cycles

    60℃

    45 sec*

    熔解曲线

    95℃

    15 sec

    1 cycle

    60℃

    60 sec

    95℃

    15 sec

    注:*当文库平均长度>700 bp时,建议延伸时间延长至90 sec

    五、数据分析

    1. 标准曲线制作

    1)根据复孔间Ct差异≤0.2的原则,对DNA Standards原始Ct进行过滤,并计算平均Ct

    2)使用有效范围内的Ct(作为纵坐标)和Log[pM](作为横坐标)绘制标准曲线。参照NTC阴性对照Ct确认标准曲线Ct有效范围。

    Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3,则最大有效CtCt (DNA Standard 6),应使用DNA Standard 1-6所产生的Ct绘制标准曲线;

    Ct (DNA Standard 6) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 5) + 3,则最大有效CtCt (DNA Standard 5),应使用DNA Standard 1-5所产生的Ct绘制标准曲线;

    Ct (DNA Standard 5) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 4) + 3,则最大有效CtCt (DNA Standard 4),应使用DNA Standard 1-4所产生的Ct绘制标准曲线;

    基于定量准确性考虑,请至少使用4Ct (DNA Standards)绘制标准曲线。如Ct (DNA Standard 4) + 3 > Ct (NTC),提示定量体系存在严重污染,需更换体系中所有组分后重复试验。

    3)绘制的标准曲线相关系数R2应不低于0.99,斜率应位于-3.1-3.6之间(表示扩增效率位于90%-110%之间)。如标准曲线参数不佳,应重复试验。

    2. 文库浓度计算

    稀释文库的Ct只有位于标准曲线有效Ct范围之内才可用于浓度计算,同时应对文库进行长度矫正。可根据下述公式计算原始文库浓度(nM):

    原始文库浓度(nM= [450 bp /文库平均长度(bp] × 稀释文库的浓度(pM× 稀释倍数/1000

    六、使用案例

    Hieff NGSTM DNA Library Quantification Kit for Illumina®定量嗜盐杆菌基因组DNA文库,文库GC含量为70%,长度450 bp。将文库稀释10000倍上机检测,结果如下图所示。根据标曲及公式,文库终浓度=4.37 pM × 稀释倍数10000=43.7 nM

    常见问题

    问题

    可能原因与解决方法

    扩增效率不在90%-110%

    1. Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) < 3或者Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,且计算扩增效率超过100%,提示反应体系有污染。应根据NTC阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染)。

    2. 不恰当的基线基线(Baseline)设置。手动调整基线(Baseline)为1-3循环。

    3. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

    相关系数R< 0.99

    1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

    2. 仪器相关问题,确保仪器与ROX匹配使用。

    标曲扩增曲线分布不均一

    1. Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,提示反应体系有污染。根据NTC

    阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染)。

    2. Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) < 3.1,提示基线基线(Baseline)设置不当。手动调整基线基线(Baseline)为1-3

    3. DNA Standards之间的ΔCt > 3.6,提示扩增效率差。确认所有试剂在使用前都已充分解冻并彻底混匀;确认所有组分浓度正确以及反应程序无误。

    4. 长时间强光照射会导致qPCR Master Mix荧光值下降,进而造成ΔCt > 3.6。应按照推荐方式避光贮存试剂。

    复孔重复性差

    1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

    2. 仪器相关问题,确保仪器与ROX匹配使用。

    文库稀释液ΔCt不在合理范围(如2倍稀释文库,ΔCt0.9-1.1

    1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

    2. 文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差。

    3. 文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用。

    文库各稀释度计算的初始文库浓度差异超过10%

    1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前完全溶解并混匀。

    2. 文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差。

    3. 文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用。

    稀释文库Ct值不在标曲Ct的有效范围

    1. 使用有效范围内的Ct值计算文库浓度。当Ct (稀释文库) < Ct (DNA Standard 1),提示文库稀释度不够,应提高文库稀释倍数重复实验。

    2. Ct (稀释文库) > Ct (DNA Standard 6),提示文库稀释度过高,应减少稀释倍数重复实验。

    3. 推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库,可额外设置32倍稀释梯度,如按1:1000稀释文库,可额外设置1:20001:40001:8000稀释比例,以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。

    DNA Standard 1扩增曲线异常

    不恰当的基线基线(Baseline)设置。手动调整基线(Baseline)为1-3循环。

    DNA Standards有扩增,而文库没有或Ct很大

    1. 文库接头序列错误。核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配。

    2. 稀释度过高。减少稀释倍数,重复实验。

    3. 文库降解。文库应现用现稀释。

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